دستگاه کروماتوگرافی مایع

دستگاه کروماتوگرافی مایع یا دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا، دستگاهی است برای انجام تکنیک ‌های جداسازی (Separation) رایج در بسیاری از علوم. کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا ( (High Performance Liquid Chromatography (HPLC) بی تردید ، سریع‌ترین رشد را در بین تمام روش‌های جداسازی تجزیه‌ای با فروش سالیانه در گستره بیلیون دلار داشته است. دلایل این رشد انفجارآمیز عبارتند از حساسیت روش ، سازگاری سریع آن برای انجام اندازه‌گیری‌های کمی دقیق، قابلیت آن برای جداسازی مواد و گونه‌های غیرفرار یا ناپایدار در مقابل گرما و مهم‌تر از همه ، کاربرد گسترده آن برای موادی است که در صنعت ، زمینه‌های مختلفی علوم و جامعه اهمیت بالایی دارند.

اجزاء دستگاه کروماتوگرافی مایع

دستگاه دستگاه کروماتوگرافی مایع شامل قسمت‌های مختلفی است که در ادامه به آنها اشاره می‌شود:

1- مخازن حلال (Solvent Reservoir)در دستگاه کروماتوگرافی مایع: که در آنها فاز متحرک و یا حلال‌ های شستشو دهنده ستون ریخته شده است.

2- موتور یا پمپ (Pump) در دستگاه کروماتوگرافی مایع: به منظور انتقال حلال و همچنین نمونه در فضای نسبتا طویل ستون، نیاز به ایجاد فشاری در سیستم است که برای ایجاد آن حداقل از یک پمپ یا موتور استفاده می‌شود. حلال (فاز متحرک) توسط پمپ با سرعت و جریان ثابتی بر روی فاز ساکن حرکت داده می‌شود. فشار سیستم به اندازه (سایز) ذرات موجود در ستون، گرانروی (Viscosity) و سرعت جریان فاز متحرک بستگی دارد. بسته به نوع جداسازی، میزان سرعت جریان فاز متحرک تعیین می‌گردد.

در مواردی که با تعددی از آنالیت‌ها مواجه هستیم، هر گونه جدا شونده، خود را به صورت یک پیک در کروماتوگرام نهایی نشان می‌دهد. در سرعت جریان کمتر فاز متحرک، فاصله بین پیک‌ها افزایش یافته و جداسازی بهتری خواهیم داشت. معمولا گفته می‌شود که در ستون‌هایی با قطر مرسوم (کمتر از µm 5 (، سرعت جریان نباید بالاتر از ml/min5/2 باشد چرا که باعث صدمه زدن به ستون و کاهش عمر مفید آن می‌شود.

دستگاه کروماتوگرافی مایع

به عنوان فاز متحرک، مخلوطی از حلال‌ها در ازای یک حلال خالص می‌تواند به‌کار گرفته شود. نسبت اجزاء فاز متحرک در طی یک تزریق ممکن است ثابت باشد که در این صورت به آن روش ایزوکراتیک (Isocratic) گفته می‌شود. در حالتی دیگر که به آن روش گرادیانت (Gradient) گفته می‌شود، طی یک تزریق و با پیشرفت زمان، طبق برنامه‌ای که از قبل برای سیستم تعریف شده است، درصد متفاوتی از دو یا چند حلال مخلوط شده و در سیستم توسط پمپ جریان می‌یابد.

قسمت های دستگاه کروماتوگرافی مایع

3- تزریق‌کننده (Injector) در دستگاه کروماتوگرافی مایع : تزریق نمونه، بسته به نوع دستگاه، به دو شکل دستی و یا خودکار انجام می‌گیرد. در روش خودکار، نمونه در ظروف مخصوصی ریخته شده و در محل تعبیه شده در دستگاه قرار می‌گیرد. پس از اینکه اپراتور دستور تزریق را (از طریق نرم‌افزار) می‌دهد، نمونه توسط یک سرنگ به سیستم منتقل می‌شود. در روش دستی، از سرنگ‌هایی با ظرفیت‌های مختلف برای تزریق نمونه استفاده می‌شود. حجم نمونه تزریق شده (در هر دو روش)، به حجم حلقه نمونه‌بردار (Loop) بستگی دارد و مقدار آن معمولاً در حد 5 تا 500 میکرولیتر است. نمونه ابتدا وارد این حلقه شده و پس ازآماده شدن سیستم به همراه فاز متحرک وارد ستون می‌شود.

4- ستون دستگاه کروماتوگرافی مایع : پس از تزریق، نمونه ابتدا وارد قسمتی به نام پیش‌ستون (Pre-column) یا محافظ ستون (Guard column) می‌شود. نقش این ستون، محافظت از ستون اصلی است. طول این ستون معمولا در حد سانتی‌متر است و جنس آن از فولاد ضد زنگ است. ماده پرکننده (Packing) ستون محافظ از جنسی مشابه ماده پرکننده ستون اصلی است. هم جنس بودن نوع پرکننده این مزیت را دارد که اگر ماده‌ای که با ذرات ستون وارد واکنش شود در نمونه موجود باشد، در ابتدا در ستون محافظ به دام افتاده و به ستون اصلی آسیب نمی‌زند. طول ستون‌های اصلی دستگاه معمولا حدود 30-10 سانتی‌متر بوده و درون ستون را با موادی که به یکی از دو فرم پوسته‌دار و یا متخلخل است، پر کرده‌اند. سایز این مواد پرکننده که بر کیفیت جداسازی تاثیر فراوانی دارد، متفاوت بوده و معمولا در حد 3 تا 5 میکرومتر است. در سیستم های UHPLC اندازه این ذرات حدود µm 2 می باشد.

دستگاه کروماتوگرافی مایع

ستون می‌تواند قطبی و یا غیرقطبی باشد. از مرسوم‌ترین ستون‌های غیرقطبی می‌توان به C18، اکتادسیل سیلان (ODS) اشاره کرد. جنس ستون‌ها از فولاد ضدزنگ (Stainless Steel) است. پس از ورود نمونه به ستون، براساس تفاوت قطبیت، اجزاء مختلف نمونه در زمان‌های متفاوتی با نام زمان بازداری (Retention Time) از یکدیگر جدا شده و برای تشخیص نوع ماده به سمت آشکارساز(Detector) هدایت می‌شوند.

در نهایت پس از اتمام کار باید ستون را شستشو دهیم. برای شستشو، بسته به نوع ستون، حلال متفاوتی را با ترتیب خاص انتخاب می‌کنیم. برای مثال در ستون‌های غیرقطبی پس از اتمام کار، ابتدا ستون را با یک حلال قطبی (معمولا آب) و سپس با یک حلال غیرقطبی (معمولا متانول) شستشو می‌دهند.

5- آشکارساز (Detector) دستگاه کروماتوگرافی مایع: آشکارساز بر اساس نوع آنالیت انتخاب می‌شود. به طور کل یک آشکارساز خوب باید دارای ویژگی‌های زیر باشد:

حساسیت بالا، قادر به اندازه گیری مقادیر ناچیز نیز باشد. باید سریعا به پیک های باریک که از درون سلول به سرعت عبور می کنند به طور صحیح واکنش نشان دهد. و در نهایت باید محکم، ارزان قیمت و تنظیمات آن ساده باشد. در ادامه به تعدادی از آشکارسازهای مرسوم در دستگاه کروماتوگرافی مایع اشاره می‌شود.

انواع آشکارساز در دستگاه کروماتوگرافی مایع

الف- از پرکاربردترین انواع آشکارساز در دستگاه کروماتوگرافی مایع طیف‌سنج UV-Vis است که برای اجسامی که در این ناحیه جذب داشته باشند مورد استفاده قرار می‌گیرد. در این آشکارساز با استفاده از تفاوت میزان جذب نمونه با منبع نوری اولیه و در نهایت با استفاده از قانون بیر لامبرت، غلظت نمونه اندازه‌‌گیری می‌شود. در مواردی که از این آشکارساز استفاده می‌شود انتخاب طول موج مناسب یکی از مواردی است که می‌بایست مد نظر قرار بگیرد. در طول موج انتخابی، نباید مزاحم‌های موجود در نمونه و همچنین حلال جذب داشته باشند.

ب- آشکارساز فلورسانس در دستگاه کروماتوگرافی مایع حساس‌تر از آشکارساز UV/Vis است ولی ترکیبات کمی موجودند که خاصیت فلورسانس داشته باشند؛ درنتیجه کاربرد این آشکارساز نیز محدود است.

دستگاه کروماتوگرافی مایع

آشکار ساز های دستگاه کروماتوگرافی مایع

ج -دتکتور PDAT در دستگاه کروماتوگرافی مایع : دتکتور PDA دستگاه HPLC امکان تشخیص در کل طیف را به صورت همزمان فراهم می آورد. عبارت دتکتور PDA مخفف Photodiode Array Detector می باشد. آشکار ساز های UV و Vis دستگاه HPLC نتایج را بر اساس دو بعد زمان و شدت نور تعیین می کنند، در حالی که دتکتور PDA بعد سوم طول موج را نیز اضافه می کند. استفاده از دتکتور PDA در کروماتوگرافی مایع، امکان تعیین مناسب ترین طول موج، بدون تکرار آنالیز را به راحتی فراهم می آورد.

د- آشکارساز ضریب شکست در دستگاه کروماتوگرافی مایع : اساس کار این آشکارساز بر مبنای تغییراتی است که در ضریب شکست سیستم حلال به تنهایی و سیستم حلال همراه با نمونه، ایجاد می‌شود. پاسخ این آشکارساز به حرارت وابسته بوده و به همین دلیل معمولا به ندرت ازآن استفاده می‌شود. این آشکار ساز عمومی بوده و برای ترکیباتی که در UV-Vis و فلورسانس جذب ندارند، مثل قندها به کار می رود.

ه- آشکارسازهای پراکندگی نور (ELSD)( Evaporative Light Scattering Detector) در دستگاه کروماتوگرافی مایع : دتکتور پراکندگی نور تبخیری حساسیت خوبی برای ترکیبات غیر فرار در سطح نانوگرم فراهم می آورد. هنگام استفاده از دتکتور ELSD، خروجی ستون HPLC اسپری شده و پس از آن تبخیر می گردد تا ذرات ریزی را ایجاد کند، سپس نور لیزر به آنالیت تابیده می شود و بازتابش پراکنده شده آن توسط دتکتور تشخیص داده می شود. نمونه های آنالیز توسط دتکتور ELSD معمولا حاوی چربی، شکر و مواد با وزن ملکولی بالا می باشند. عملکرد دتکتور ELSD تقریبا مشابه دتکتور RI می باشد اما حساسیت تشخیصی بالاتر و پایداری مناسب تری را نسبت به آن فراهم می کند. از دیگر مزایای شناساگر ELSD نسبت به دتکتور RI کاربرد آن در متد گرادیان در آزمایشگاه می باشد

دستگاه کروماتوگرافی مایع

آشکارساز در دستگاه کروماتوگرافی مایع

و- آشکارساز الکتروشیمیایی در دستگاه کروماتوگرافی مایع : که عملکرد آن برپایه واکنش‌های اکسید و احیا می‌باشد و شامل روش‌های آمپرومتری(Amperometry) پلاروگرافی (Polarography)، کلون‌سنجی (Coulometry) و هدایت‌سنجی (Conductometry) است.

ی- آشکارساز طیف‌سنج جرمی (MS) در دستگاه کروماتوگرافی مایع : این مورد امروزه به دلیل مزایای زیادی که دارد به طور وسیعی مورد استفاده قرار می‌گیرد. از این جمله می‌توان به حد تشخیص (LOD) بسیار پایین، حساسیت و انتخابگری (Selectivity) بالا، و امکان بررسی نمونه در حضور مزاحم‌های شیمیایی اشاره کرد.

در صورتیکه از هیچ کدام از این موارد نتوان استفاده کرد، از مشتق‌سازی (ایجاد تغییرات شیمیایی روی نمونه) جهت ایجاد نمونه فعال در هر یک از این آشکارسازهای ذکر شده استفاده می‌شود. شکل زیر نمایی از یک دستگاه HPLC را به همراه اجزاء مختلف آن به تصویر کشیده است.

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا، روشی مناسب جهت جداسازی، اندازه‌گیری، و تعیین نوع مواد است. این تکنیک با تلفیق با روش‌های دیگر و آشکارسازهای پیشرفته‌ای مانند طیف‌‍سنج جرمی کاربردهای زیادی در علوم مختلف دارد. انتخاب فاز متحرک و ثابت، انتخاب آشکارساز و تعیین سرعت جریان فاز متحرک از جمله موارد اساسی در تنظیمات یک روش مناسب HPLC است.